大曲作为糖化发酵剂，为白酒酿造提供了重要且丰富的菌系、酶系和物系，即为后续窖内酒醅发酵提供微生物，将原料降解成小分子物质的水解酶或催化酯类物质合成的酯化酶，以及白酒风味物质或其前体物。大曲生产过程通常包括1 个月左右的主发酵期和2～6 个月左右的贮存期。近年来，关于大曲主发酵期间微生物群落及功能变化机制的研究非常活跃，而贮存期大曲微生物群落结构、酶系以及风味物质变化也越来越受到关注。总之，现有研究显示贮存过程对大曲质量具有重要影响，但关于贮存期大曲微生物群落结构及代谢产物变化机制的研究鲜有报道。

　　四川轻化工大学生物工程学院的徐千惠，罗惠波，黄丹*等通过高通量测序解析浓香型大曲的曲心和曲皮在贮存期间发生的微生物群落结构变化，并分析糖化酶、液化酶活力的变化，利用HS-SPME-GC-MS研究挥发性代谢产物的差异，构建零模型解析微生物群落的组装过程，运用相关性分析探究糖化力、液化力、风味物质与大曲微生物之间的联系，揭示浓香型大曲贮存期菌系、酶系以及物系的变化机制，为优化大曲贮存工艺、提高大曲质量提供理论依据。

　　大曲微生物在持续进行的贮存过程中此消彼长，采用高通量测序技术对其演替情况进行解析。在大曲贮存期间共注释到16 个细菌门和4 个线 个真菌属，其中将平均相对丰度前10的优势微生物属变化情况绘制成柱形图展示。由图1a可知，曲皮在入库贮存第0天的主要优势细菌是芽孢杆菌属（

　　Bacillus）（23.69%）、假单胞菌属（Pseudomonas）（26.58%）、魏斯氏菌属（Weissella）（20.94%）等，这种优势地位到了贮存第43天被链球菌属（Streptococcus）（33.31%）、放线菌属（Actinomyces）（18.83%）取代。贮存第43～108天，魏斯氏菌属迅速生长成为绝对优势细菌（1.41%～63.08%）。贮存第108天和第161天的曲皮细菌组成较为相似，这与唐贤华等得出的贮存期导致大曲微生物种类趋于平稳的研究结论一致。并且有研究结果可以解释这一现象：贮存过程中温度、水分、酸度等环境条件的变化会导致大曲微生物之间进一步相互作用，使群落结构趋于相似，最终形成一种稳定体系。而在曲心，贮存前43 d的细菌组成较为一致，由芽孢杆菌属、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、假单胞菌属、葡萄球菌属（Staphylococcus）等组成。假单胞菌属的相对丰度最高，呈明显的上升趋势（15.84%～76.70%），而芽孢杆菌属在持续下降（43.24%～9.23%）。葡萄球菌属在贮存前9 d的含量较为丰富（12.73%～10.74%），随后立即让位给其他细菌，在贮存第108～161天的相对丰度保持在0.42%～1.67%。随着贮存时间的延长，除了芽孢杆菌属的相对丰度在10%左右波动外，其余在贮存开始时呈明显优势的细菌都在衰减，而乳杆菌属（Lactobacillus）、放线菌属、链球菌属、肠球菌属（Enterococcus）等相对丰度增加。由图1b可知，曲皮和曲心在贮存过程中的真菌皆以嗜热子囊菌属（Thermoascus）为主，其相对丰度在曲皮和曲心中的变化规律大体一致，均从一个极高的相对丰度（96.89%、93.29%）波动下降。其次是曲霉属（Aspergillus），在贮存第0天几乎没有，而后大量生长，但不同的是从贮存第9天开始，曲霉在曲心中总体呈波动上升趋势（22.17%～30.35%），而在曲皮中呈快速下降趋势（60.82%～2.41%）。毕赤酵母属（Pichia）在曲心中的相对丰度很低（0%～0.96%），但在曲皮中却大量生长，是曲皮在贮存第108天的绝对优势线%）。

　　总体看来，大曲贮存过程使曲皮中的魏斯氏菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属和曲心中的高温放线菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、曲霉属的相对丰度得到了极大提高，同时使曲皮和曲心中的芽孢杆菌属、假单胞菌属、嗜热子囊菌属等的相对丰度下降。此外，曲皮中others的变化情况显示了大曲中一些原本的极低丰度微生物可能由于适应曲库的环境条件以及微生物之间友好的相互关系而大量生长，同时一些微生物因为适应性差而走向衰竭。这些结果都表明贮存使大曲微生物间相互作用重新平衡，改变了微生物群落组成。

　　多样性指数如图2所示。Chao1指数反映物种的丰富度，大曲贮存前43 d的微生物丰富度相差不大，随着贮存时间的延长，曲心中细菌的Chao1指数在贮存第108天增长至最大，而线天达到最高值后减小。总体看来，贮存过程使大曲微生物的丰富度略有降低。Pielou’s evenness指数表征均匀度，在大曲贮存期间，微生物群落的均匀度呈现先增加再减少的趋势。贮存第161天的细菌群落均表现出稍稍低于贮存第0天的均匀度，而真菌群落的均匀度总体增加，表明贮存过程塑造了更为均匀的真菌群落。Shannon指数反映物种多样性，大曲的物种多样性与均匀度的变化趋势较为相似，总体上贮存过程增加了大曲的微生物多样性。

　　为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化，对大曲样品进行PCoA。由图3a可知，PC1和PC2对细菌群落组成差异的解释度分别为29.63%和22.15%，共计51.78%。贮存前43 d的曲心细菌结构相近，但曲皮细菌样本相互分离较远，说明贮存前43 d内曲皮细菌结构发生了明显变化。贮存第108、161天曲心和曲皮的细菌样本各自聚在一起，表明大曲贮存3 个月后，细菌结构已经趋于稳定，这与以往的研究一致。如图3b所示，PC1和PC2对真菌群落组成差异的解释度分别为53.02%和41.79%，总解释度高达94.81%。曲心的真菌结构总体距离相近，说明曲心真菌结构在贮存过程中变化不大，并且与贮存第0、43、161天的曲皮真菌结构相似性较高，但分别与曲皮在第9、108天的真菌结构相差甚远。为进一步了解大曲贮存期间微生物群落结构，Venn图展示了不同贮存时期间的共有微生物及特有微生物数量。如图4所示，在属水平上，曲皮、曲心在5 个贮存时期分别有13、14 个共有物种，其中绝大部分如曲霉属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属、魏斯氏菌属等都属于图1中的优势菌属，但它们在贮存不同时期的相对丰度各不相同。曲皮和曲心在每个贮存时期的特有物种数量总和分别占53%和50%，表明大曲贮存过程中的微生物差异由一半的共有物种的丰度差异和一半的特有物种的物种差异组成。这些结果同样表明一些原本的极低丰度微生物可能会随着贮存的进行大量生长，同时一些微生物丰度降至极低，也有研究显示部分特有低丰度微生物来自贮存环境。

　　糖化酶是微生物代谢产生的重要酶类，能将酿酒原料中的淀粉、纤维素等多糖降解为还原糖，再由酵母等微生物进一步转化为乙醇，因此糖化力是大曲重要的生化指标。由图5a可知，曲皮糖化力在贮存前108 d先上升后下降（272、398、107 mg/（g·h）），在贮存第108～161天内大幅回升（107～256 mg/（g·h））。而曲心糖化力在48～187 mg/（g·h）之间呈现比较规律的波动。液化酶能断裂淀粉分子的

　　-1,4-糖苷键生成糊精等中间产物。图5b所示的曲皮液化力在贮存第0～43天内略有降低（0.37～0.12 g/（g·h）），从贮存第43天开始持续增加至贮存结束（0.12～0.30 g/（g·h））。曲心液化力在贮存前43 d内维持在0.08 g/（g·h），之后快速上升并稳定在0.27～0.21 g/（g·h）。总体看来，与以往的研究一致，糖化力和液化力在贮存约43 d内呈下降趋势，随后整体回升。曲皮的糖化力和液化力均在贮存后略微降低，而曲心中的二者在贮存后升高。有研究表明，大曲在贮存初期具有较高的液化和糖化活性，且二者往往呈正相关，后来酶活性降低，转变为较高的酯化活性，这与贮存后期酯类物质含量快速增加有关。

　　大曲中的风味物质可以作为酒体中香气物质的直接来源，也可作为酒中香气物质的重要前驱物来源。采用HS-SPME-GC-MS分别在贮存过程的曲心和曲皮位置检测到67、70 种挥发性化合物，可分为醇类、酯类、酚类、酸类、醛酮类、烷烯类、吡嗪类和其他物质。由图6可知，曲皮中风味物质的总含量随着贮存时间呈现先下降后上升再下降的变化趋势，其中在贮存约3 个月时总含量达到最高，这在其他报道中也有同样的发现，相比之下，曲心中的风味物质含量总体较为稳定，仅在贮存结束时发生了较大的下降。酯类物质是中国白酒中令人愉悦的水果、花香、蜂蜜香气的主要贡献者，是贮存期间占比最大的挥发性风味物质，令人注意的是其在曲皮贮存第108天时发生了激增，与前述微生物群落演替结果相结合，推测这种变化可能与魏斯氏菌和毕赤酵母的剧烈增加有关。据报道，魏斯氏菌发酵产生乳酸，为乳酸乙酯的合成提供前体物质，毕赤酵母能利用蔗糖和葡萄糖制造乙酸乙酯等芳香化合物，二者均在酯化过程中发挥重要作用。醇作为酸和酯的重要前体物质，其含量仅次于酯类，在贮存期间变化幅度不大。酸类、烷烯类、醛酮类物质的变化比较一致，表现为贮存初期有较高的含量，之后迅速下降，并在之后的贮存期间保持非常低的含量。总体上，贮存过程使风味物质总含量减。